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1961年，美國科學(xué)家Leonard Hayflick的研究首次揭示，細(xì)胞并非永遠(yuǎn)具有增殖能力，它們會(huì)因各種內(nèi)外壓力進(jìn)入衰老狀態(tài)。幾十年來，科學(xué)家們圍繞這一現(xiàn)象展開了大量研究，發(fā)現(xiàn)這些衰老細(xì)胞在許多疾病中起到了推波助瀾的作用。

Leonard Hayflick在實(shí)驗(yàn)室

為了清除衰老細(xì)胞，試圖延緩衰老?？茖W(xué)家們提出了”靶向治療“的策略，但這一策略面臨一個(gè)核心挑戰(zhàn)：我們難以精確區(qū)分哪些衰老細(xì)胞對健康有益，哪些細(xì)胞對身體有害。正因如此，抗衰老療法可能無意間清除了有益的細(xì)胞，反而削弱了人體自然的保護(hù)機(jī)制，最終得不償失。

針對這一難題，來自中國科學(xué)院大學(xué)、上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的研究人員近日在權(quán)威期刊《Cell》上發(fā)表了一篇名為“Identifying specific functional roles for senescence across cell types”的文章，提出了全新的研究思路。他們嘗試通過雙重組酶遺傳系統(tǒng)，精確靶向了不同類型的衰老細(xì)胞，并深入探討了它們在衰老、疾病和再生過程中的具體功能。

前面我們提到，衰老細(xì)胞的存在是一種由內(nèi)外環(huán)境的壓力所引發(fā)的生理狀態(tài)，其特征包括細(xì)胞增殖的終止、特定抑制蛋白（如p16和p21）的表達(dá)、細(xì)胞衰老標(biāo)志物（如衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶）的活性增加，以及一系列炎癥因子和蛋白質(zhì)分泌的增加，這種現(xiàn)象被稱為衰老相關(guān)分泌表型（SASP）。

衰老細(xì)胞存在一系列的特征，因此我們可以識別它們

根據(jù)這些特性，研究人員已經(jīng)開發(fā)了許多種方法來識別和標(biāo)記衰老細(xì)胞，其中p16 Ink4a是最常用的標(biāo)志物之一。p16 Ink4a可以通過抑制CDK4/6，阻止細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期?？茖W(xué)家利用p16 Ink4a相關(guān)的基因工程小鼠模型，能夠在活體中檢測出衰老細(xì)胞的分布。

有趣的是，p16 Ink4a陽性細(xì)胞在年輕且健康的組織中幾乎無法檢測到，但隨著年齡的增長或疾病的發(fā)展，它們會(huì)在老化的組織中逐漸積累。研究表明，通過基因或藥物手段清除這些p16 Ink4a+ 細(xì)胞，能夠延長早衰小鼠的壽命，并在多種老化相關(guān)的疾病中顯示出積極的效果，例如心臟肥大、動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)流失、阿爾茨海默病、糖尿病等。

然而，衰老細(xì)胞也并不總是“壞人”。一些研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，衰老細(xì)胞有助于抑制腫瘤的發(fā)生，促進(jìn)傷口愈合，甚至在胚胎發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色。此外，它們還能支持某些重要細(xì)胞如胰島β細(xì)胞的功能，幫助緩解肺部壓力，促進(jìn)器官再生和細(xì)胞重編程。

中科大的最新研究就能幫助我們精準(zhǔn)區(qū)分不同類型的衰老細(xì)胞，通過精確靶向不同類型的衰老細(xì)胞，來更好地調(diào)控衰老過程，進(jìn)而改善人類健康。

p16 -tdT小鼠衰老過程中多種細(xì)胞類型表達(dá) tdT

研究人員首先需要解決的問題是，搞清楚哪些類型的p16 Ink4a +細(xì)胞會(huì)在衰老過程中表現(xiàn)出衰老表型。為了解決這個(gè)問題，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于熒光的報(bào)告基因模型，并將其命名為p16-tdT。簡單來說，研究人員會(huì)將一個(gè)熒光基因盒（tdTomato，簡稱tdT）插入到Cdkn2a基因的特定位置，以便在細(xì)胞中熒光標(biāo)記那些表達(dá)p16 Ink4a的細(xì)胞。

通過對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）的實(shí)驗(yàn)，研究人員驗(yàn)證了這種新模型的有效性。隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，衰老細(xì)胞的標(biāo)志物如SA-β-Gal也出現(xiàn)了增加，而細(xì)胞增殖相關(guān)的Ki67卻出現(xiàn)了減少，這表明細(xì)胞進(jìn)入了衰老狀態(tài)。同時(shí)，p16 Ink4a的表達(dá)出現(xiàn)了顯著增加，并且與tdT熒光信號表現(xiàn)一致，這證明這個(gè)基因報(bào)告系統(tǒng)確實(shí)能夠準(zhǔn)確反映p16的表達(dá)水平。

進(jìn)一步分析顯示，這些細(xì)胞還表現(xiàn)出其他的衰老標(biāo)志物，如p21、DNA損傷的γH2AX信號以及IL-6增高和層蛋白B1的減少。

但總而言之，團(tuán)隊(duì)通過敲低p16 Ink4a基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該報(bào)告系統(tǒng)和抗體的特異性，表明p16-tdT小鼠系能夠可靠地追蹤和分析細(xì)胞的衰老過程。這一模型為接下來研究不同細(xì)胞類型在衰老中的作用提供了有力的工具。

巨噬細(xì)胞和 EC 是 CCl 4處理后具有衰老特征的主要p16 Ink4a +細(xì)胞類型

作為和細(xì)胞衰老息息相關(guān)的肝纖維化進(jìn)程，研究人員打算從這個(gè)角度入手，研究它們之間的具體關(guān)聯(lián)。談到肝纖維化，這個(gè)疾病實(shí)際上是由一種特殊細(xì)胞 -- 肌成纖維細(xì)胞的過度激活導(dǎo)致的。這些細(xì)胞不僅會(huì)大量增殖，還會(huì)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（類似于“身體的膠水”），導(dǎo)致肝臟最終變得硬化和僵硬。

肌成纖維細(xì)胞的過度激活在肝纖維化的進(jìn)程中占了非常大的比重

為了研究衰老細(xì)胞對肝纖維化的具體影響，研究人員使用了一種常見的肝損傷模型，通過四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)肝纖維化。他們利用了一種特殊的基因標(biāo)記小鼠，能顯示衰老細(xì)胞的位置。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種受CCl4處理的小鼠肝臟中，衰老細(xì)胞出現(xiàn)了顯著增多，而且這些細(xì)胞多數(shù)都集中在纖維化嚴(yán)重的區(qū)域。

通過進(jìn)一步分析，研究人員確認(rèn)了在這些區(qū)域內(nèi)，有一些特殊的細(xì)胞類型，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（血管內(nèi)皮的組成部分）和巨噬細(xì)胞（負(fù)責(zé)清除體內(nèi)“垃圾”的細(xì)胞），它們都表現(xiàn)出了衰老的特征。這提示這些細(xì)胞的衰老可能在肝纖維化的進(jìn)展中起到了重要的作用。

接著，研究人員利用了更為精細(xì)的技術(shù)如流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在纖維化肝臟中占了很大的比例，且這些衰老的細(xì)胞表達(dá)了大量促炎癥因子和組織重塑相關(guān)蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)加劇了肝臟的損傷和纖維化。

最后，研究團(tuán)隊(duì)還通過另一種非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的模型驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)，再次證明了巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的衰老在肝纖維化中的關(guān)鍵作用?？傮w來說，研究表明，這些衰老細(xì)胞通過釋放多種炎癥因子和組織重塑因子，推動(dòng)了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

Sn-pTracer 能夠以細(xì)胞類型特異性的方式對p16 Ink4a +細(xì)胞進(jìn)行譜系追蹤

為了通過p16 Ink4a + 巨噬細(xì)胞的基因消融技術(shù)來改善和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程，研究人員開發(fā)了一種全新的遺傳示蹤系統(tǒng)，稱為“衰老細(xì)胞-Cre誘導(dǎo)示蹤劑”（Sn-cTracer）。

相比之下，傳統(tǒng)的 Sn-pTracer 系統(tǒng)雖然能夠追蹤細(xì)胞衰老，但及其依賴 Dre 驅(qū)動(dòng)器，這種組織特異性的驅(qū)動(dòng)劑難以獲得。此外，這種藥物還需要持續(xù)使用，才能維持對衰老細(xì)胞的追蹤，但長期使用會(huì)增加實(shí)驗(yàn)負(fù)擔(dān)，還可能引發(fā)未知的健康問題。

為了解決這些問題，新開發(fā)的 Sn-cTracer 系統(tǒng)簡化了追蹤過程，無需長期的藥物治療，且減少了相關(guān)的毒副作用。它的設(shè)計(jì)原理涉及三種小鼠品系：一種細(xì)胞類型特異性的Cre驅(qū)動(dòng)程序、p16-LSL-Dre小鼠，以及報(bào)告小鼠品系R26-RL-tdT-DTR。通過Cre-loxP系統(tǒng)的激活，能夠精準(zhǔn)地追蹤p16 Ink4a +細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，并實(shí)現(xiàn)這些細(xì)胞的基因消融。

這種新系統(tǒng)不僅提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性，還允許在任何特定細(xì)胞類型中對p16 Ink4a +細(xì)胞進(jìn)行高效的遺傳記錄和靶向處理。

消除p16 Ink4a +巨噬細(xì)胞可改善肝纖維化

總的來說，該研究通過探究p16 Ink4a +細(xì)胞在肝纖維化進(jìn)程中扮演角色的過程中總結(jié)出了以下影響：

巨噬細(xì)胞的作用：

p16 Ink4a +巨噬細(xì)胞在肝纖維化中發(fā)揮了促進(jìn)作用。這類衰老巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出衰老相關(guān)分泌表型（SASP），分泌的炎癥因子和生長因子可能會(huì)進(jìn)一步激活成纖維細(xì)胞，加劇纖維化反應(yīng)。因此，去除p16 Ink4a +巨噬細(xì)胞可以有效抑制纖維化進(jìn)程，限制組織損傷。

內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)功能：

相比之下，p16 Ink4a +內(nèi)皮細(xì)胞在肝臟修復(fù)過程中具有保護(hù)作用。它們在纖維化后的修復(fù)階段通過維持血管生成和清除代謝廢物來幫助恢復(fù)肝臟功能。內(nèi)皮細(xì)胞是血管的主要組成部分，它們在保持血液與肝組織間的屏障功能、清除毒素方面起著關(guān)鍵作用。如果去除這些細(xì)胞，可能會(huì)破壞肝臟微環(huán)境，導(dǎo)致廢物積累、炎癥加劇，并進(jìn)一步激活纖維化。

VEGF信號的調(diào)節(jié)作用：

VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）信號在維持內(nèi)皮細(xì)胞的健康功能和促進(jìn)血管生成方面至關(guān)重要。研究表明，通過激活VEGF信號通路，可以防止衰老導(dǎo)致的血管功能下降，從而減少纖維化。尤其是在老年肝臟中，VEGF信號的加強(qiáng)能夠恢復(fù)衰老內(nèi)皮細(xì)胞的功能，改善血管生成，進(jìn)而減輕纖維化。

基因調(diào)控與肝纖維化的聯(lián)系：

研究通過在p16 Ink4a +內(nèi)皮細(xì)胞中過度表達(dá)Kdr基因，增強(qiáng)了它們的增殖能力，并減少了SASP表達(dá)。這種基因調(diào)控方式有效提高了內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力，促進(jìn)了代謝毒素的清除，減少了纖維化反應(yīng)。

總體影響：

p16 Ink4a +細(xì)胞在肝纖維化中既有促進(jìn)纖維化的成分（如巨噬細(xì)胞），也有修復(fù)肝臟的成分（如內(nèi)皮細(xì)胞）。通過有選擇性地消除有害的p16 Ink4a +巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)p16 Ink4a +內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)功能，可以有效減輕纖維化并促進(jìn)肝臟的恢復(fù)。這一發(fā)現(xiàn)為未來開發(fā)更具針對性的抗纖維化治療提供了新的方向！